pcr制冷片配对(pcr冷启动法)

<h2>1. pcr冷启动法</h2><p>1、按 PCR 仪正面左下角电源开关，启动 PCR 仪。</p><p>2、放 PCR 离心管，先把顶盖向上扳，再往前推，露出放样孔，PCR 管</p><p>放入前应加好反应体系各组分，再放入 PCR 离心管。</p><p>3、反向重复第二步骤将顶盖板向后拉，盖好顶盖。</p><p>4、按 F2“Create”新建一个扩增的 PCR 程序。</p><p>5、按控制台面右方上下左右方向键，可随意移动编辑位置，输入需要</p><p>的温度、时间、循环数等。</p><p>6、据 PCR 离心管中加入的反应体积总量，在“Reaction volume”后输入</p><p>相应数值，有 Std“1～100ul”和 9600“1~50ul”两档可供选择。</p><p>7、按 F1“Start”启动</p><p>8、按“INFO”对应键查看 PCR 结束键。</p><p>9、扩增完成后按台面左方“Stop”键退出。</p><p>10、按“Hist”，可查看上次扩增的历史记录。11、完全退出后，按台面左下方电源开关，拔出插销，切断电源。</p><h2>2. pcr制冷模块</h2><p>实验室的标准温度为20℃，相对湿度保持在50－70％。随着对质量控制的要求越来越严格，恒温恒湿环境的需求越来越大，应用的领域也越来越宽广。实验室空调是温湿度控制的心脏，要求精度高，故障率低。恒温恒湿试验：规格型号：LRHS-025-SGD/BJYSL-DHS-100湿度范围：85%～98%RH温度均匀度：±2℃ （空载时）湿度均匀度：±3%RH温度偏差：±2℃控制精度达：温度精度±1.0℃，湿度精度达±2.0% 以内的恒温恒湿空调，称为高精密恒温恒湿空调。扩展资料：实验室空调：实验室空调要求精度高，故障率低。所以必须要求空调能调节制冷量，市面上已有两种方式：一种是变频调节；另一种是冷冻水调节方式。实验室中风量越大，送风焓差越小，温湿度越均匀；但风量越大，除湿能力越小，甚至完全丧失，所以高精密恒温恒湿空调要求保证除湿能力的基础上尽可能大风量，对风量的设计非常严格，而普通机房空调要求较低。</p><h2>3. 热启动pcr程序设置</h2><p>pcr封膜机的使用方法是</p><p>1、按 PCR 仪正面左下角电源开关，启动 PCR 仪。</p><p>2、放 PCR 离心管，先把顶盖向上扳，再往前推，露出放样孔，PCR 管放入前应加好反应体系各组分，再放入 PCR 离心管。</p><p>3、反向重复第二步骤将顶盖板向后拉，盖好顶盖。</p><p>4、按 F2“Create”新建一个扩增的 PCR 程序。</p><p>5、按控制台面右方上下左右方向键，可随意移动编辑位置，输入需要的温度、时间、循环数等。</p><p>6、据 PCR 离心管中加入的反应体积总量，在“Reaction volume”后输入相应数值，有 Std“1～100ul”和 9600“1~50ul”两档可供选择。</p><p>7、按 F1“Start”启动</p><p>8、按“INFO”对应键查看 PCR 结束键。</p><p>9、扩增完成后按台面左方“Stop”键退出。</p><p>10、按“Hist”，可查看上次扩增的历史记录。</p><p>11、完全退出后，按台面左下方电源开关，拔出插销，切断电源。</p><h2>4. pcr热启动是什么意思</h2><p>实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。主要实验步骤如下：</p><p>1.设计并合成RealtimePCR引物。</p><p>2.引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR®Green）的PCR反应的优化。</p><p>3.样品RNA抽提a．实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。b．实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。</p><p>4.RNA质量检测a．紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。b．使用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。</p><p>5.使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。</p><p>6.制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线7.标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTimePCR反应液中（其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司），进行RealTimePCR扩增和检测8.检测结果进行标准曲线分析，以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。 </p><h2>5. pcr启动子</h2><p>T7启动子TAATACGACTCACTATAGGGAGA.可以控制其下游的基因表达。T7引物，一般都是用来做测序（不是PCR）用的。只要某个质粒带有T7启动子，都可以用T7引物来对其下游的DNA进行测序。T7引物的序列和T7启动子的序列互补。</p><h2>6. pcr技术冷却降低温度的原因</h2><p>DNA分子受热变性，双链分开，若再缓慢冷却至室温，则在260nm处吸光度降到变性前的值，这一过程称为“退火”。经退火处理，可使变性DNA的两条多核苷酸链重新聚合。</p><h2>7. pcr原理</h2><p>PCR反应的原理由变性→退火→延伸三个基本反应。</p><p>①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。</p><p>②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。</p><p>③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。</p><p>重复循环变性→退火→延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。</p>