pcr要在冰上做?(pcr需要在冰上操作吗)

<h2>1. pcr要在冰上做?</h2><p>是说95度几分钟然后缓慢降温到室温那种吗？这种缓慢降温程序通常用于核酸单链合成双链用的。降温太快，很容易形成单链内部的二级结构。一般而言，越长的单链，降温速度就要越慢。比如说，合成CRISPR用的小gRNA，两条DNA oligo也就20+个碱基，这时降温速度可以设为5度/分钟。而像60-70 nt的DNA单链要杂交成双链，我会用1度/分钟。</p><p>过去一些做分子多态的老旧技术，比如PCR-SSCP，就会反其道而行，在高温变性PCR产物后直接插冰上迅速降温，使得DNA单链内部形成二级结构，再去跑PAGE胶看带型。</p><h2>2. pcr需要在冰上操作吗</h2><p>如果说最基本的，当然是</p><p><p>载体、目的基因、宿主细胞和工具酶</p></p><p>恩，就这么简单，最基本的</p><p>如果你要实际操作的话，以质粒基因工程改造酵母菌为例(需要的设备材料用粗体标注)：</p><p>首先<p>移液管/移液器+无菌枪头</p>是必备物品</p><p>你需要含有质粒的<p>细菌</p>(一般是大肠杆菌)，将它在<p>超净工作台</p>中接种在培养细菌的<p>液体培养基</p>中(一般是LB培养基)，在<p>恒温摇瓶柜</p>里摇瓶培养到足够浓度，用<p>质粒抽提盒(试剂盒)+离心机</p>将细菌溶解，沉降掉蛋白质、拟核和其他杂质，提取出来质粒，其中还需要使用<p>60°C恒温鼓风箱和37°C恒温培养箱</p>，再用<p>光度计</p>测质粒浓度。</p><p>将提取出来的质粒加入<p>限制性核酸内切酶</p>以及<p>Buffer(酶发挥活性所需环境缓冲液)</p>，置于<p>37°C水浴锅</p>中保温，至于保温多久看多贵的酶了。</p><p>保温结束后，使用<p>DNA柱回收试剂盒</p>和离心机将切好的质粒回收，去掉酶和其他东西。再加入用同样方法切割好的、具有相同黏性末端的<p>目的基因</p>，<p>DNA连接酶</p>和<p>Buffer</p>，置于<p>16°C培养箱</p>水浴培养，时间也是看酶多贵。</p><p>取细菌(大肠杆菌)制备<p>感受态细菌</p>保存于<p>-70°C冰箱</p>中，制备过程不赘述，其中需要使用<p>冷冻离心机</p>。用同样方法柱回收连接产物并加入在冰上解冻的感受态细菌悬液中，<p>42°C水浴锅</p>热击90秒再置于冰上，加入LB液体培养基并置于恒温摇瓶柜培养使细菌恢复生长。</p><p>制备<p>含抗生素(一般是氨苄青霉素)的LB固体培养基</p>并倒在<p>培养皿</p>中冷却，用<p>涂布棒</p>将大肠杆菌涂到平板上倒置于37°C培养箱培养，筛选出转化成功含有氨苄抗性基因的大肠杆菌。挑取部分单菌落置于添加了<p>Loading(染色剂)、热稳定DNA聚合酶、Buffer、dNTP、引物RNA</p>的<p>PCR小管</p>中，在<p>PCR仪</p>中扩增。</p><p>制备<p>琼脂糖和TAE缓冲液配比并添加DNA染色剂(接触毒性)</p>做的<p>核酸凝胶</p>，将PCR产物和<p>Marker(条带大小的指示剂)</p>点样在凝胶中用<p>核酸凝胶电泳仪</p>检测含有目的基因质粒的是哪一个菌落</p><p>确定是哪个菌落后，挑取该菌落接种在新的LB液体培养基中摇瓶培养，用同样的方法提取重组质粒，制备<p>感受态酵母菌</p>并将重组质粒加入转化。</p><p>制备<p>含抗生素(同上)的YPD固体培养基</p>并将转化产物涂布在平板上筛选，并进行PCR验证或进一步验证它的目的基因表达产物即可。基因工程的操作到这基本就算完了。</p><p>————分割线————</p><p>如果是动植物细胞，也就是转化的方式有所不同，比使Ti质粒转座子、基因枪、显微注射、病毒侵染等。</p><p>以上是我们实验室的操作方法，实验室不同甚至预算不同都会引起方法有略微的差别。比如有一些繁琐的步骤只要买一个试剂盒就能解决，但是试剂盒也不便宜就是了。</p><p>如果你要了解，那这些基本够了</p><p>如果你要亲手实践一下，劝你还是联系实验室吧，毕竟这些东西就算土豪也肉疼……</p><h2>3. qpcr需要在冰上做吗</h2><p>因为qpcr的模板在常温容易降解，在冰上操作是为了减少模板的降解。</p><h2>4. pcr体系配好了放冰箱</h2><p>PCR扩增之后的样品放了很久还能用吗 是放在-20度冰箱的，差不多两个多月了对于PCR产物，一般要求纯化后再保存，洗脱液为TA或者纯水，为了后续实验的方便，是不会再加甘油的，所以，保存时间肯定无法和加了甘油的marker比较；对于比较重要的PCR产物，建议：</p><p>1. 分装保存，避免反复冻融；2.-70℃比-20℃要更好，半年是没问题；3. 冻干粉保存时间更长，可长达数年。</p><h2>5. pcr冰箱</h2><p>当然是越早放进去越好，但是我师姐以前取完组织之后还要拍照，因此在室温中放置了挺长时间，然后才放到液氮里，后来做的real-timePCR还有western，效果也不错，所以应该没问题</p><p>不过最好是不要放在-80，而是放在液氮里。</p><h2>6. 荧光pcr最好在冰上做吗</h2><p>PCR仪的热盖大致可以分为以下四种：非可调式热盖、可调节式热盖、自适应式热盖和自动式热盖</p><p>1、非可调式热盖：即热盖并不能同时适用于高管和矮管，如AB的2720等只能用高管，用矮管得手工加铝块；</p><p>　2、可调节式热盖：即热盖的高度可以手工调节，同时适用于各种高管和矮管，但压力需要自己感觉，用力过小或过大都可能会有麻烦，如MJ公司的PTC200。因为有这个问题，后来又出了力矩式可调热盖，即热盖旋转到一定力矩后内置机构打滑，从而保证一定的热盖压力。如东胜龙的黑金刚以及Biometra等。这类热盖打开前最好旋松热盖，否则下一个用户如果直接下压热盖，可能造成部分PCR管变型。但很多用户会忘记松热盖。</p><p>　3、自适应式热盖：即热盖自带预压紧的弹簧，通过与打开和关闭热盖的手柄机构相结合，达到压手柄时自动压紧热盖，开手柄时自动松开热盖，自适应高管和矮管，不用担心压力和没有松开热盖等问题。如东胜龙二代的ETC811型PCR仪。</p><p>　4、自动式热盖：即热盖是由电机来控制的压紧与松开的。一般用于与实验室自动化相配合的PCR仪，或称为全自动PCR仪，如原MJ公司以及Biometra公司都此类PCR仪，但价格都较高。</p>